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El valor de la tecnología MALDI-TOF en la identificación a nivel de especie.


¿Qué es la tecnología MALDI-TOF?


La ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI) utiliza un láser para absorber energía de una matriz para crear iones con una fragmentación mínima de moléculas grandes. Puede analizar biopolímeros como ADN, proteínas, péptidos, carbohidratos y otras macromoléculas orgánicas. En la espectrometría de masas (MS) de tiempo de vuelo (TOF) MALDI, un analizador TOF mide la relación masa-carga (m/z) de las moléculas cargadas.


Es fundamental identificar y diferenciar los microorganismos cuando se realizan ensayos para diagnosticar enfermedades, identificar una fuente de contaminación o estudiar los efectos de los tratamientos o las condiciones ambientales en las poblaciones microbianas. Uno de los métodos proteómicos más potentes, MALDI-TOF MS, es una forma rápida, precisa y económica de reconocer y diferenciar microorganismos, como bacterias, virus, parásitos y hongos. Esta tecnología produce espectros de masa específicos únicos para cada microorganismo y, por lo tanto, puede identificarlos con precisión a nivel de género y especie.1,2


MALDI-TOF MS compara los espectros producidos por células intactas con una base de datos de espectros de una manera simple y rápida, lo que lo hace ideal para su uso en un entorno de laboratorio de diagnóstico. Desarrolla bases de datos de picos únicos y diferenciados que pueden usarse para identificar especies y subespecies independientemente de las condiciones utilizadas para cultivar el microorganismo.


Otra característica de MALDI-TOF MS consiste en hacer coincidir las masas de biomarcadores con una base de datos de proteomas: las proteínas son las biomoléculas más observadas con una relación masa-carga superior a 4000 m/z en los espectros MALDI-TOF derivados de extractos de células completas. Por lo tanto, un algoritmo puede predecir masas de proteínas a partir de un genoma secuenciado y buscar coincidencias con masas derivadas experimentalmente. Este enfoque basado en la bioinformática es superior al fingerpriting bacteriano, ya que puede identificar microorganismos a pesar de las variaciones en los perfiles de proteínas, el crecimiento del cultivo y las condiciones de tratamiento de las muestras. También puede detectar toxinas microbianas y analizar la resistencia a los antibióticos.3-6


La importancia de la identificación a nivel de especie en el contexto farmacéutico


El género de un organismo en particular no es un indicador preciso de su especie. De esto se deduce que la identificación de género por sí sola ya no es suficiente al evaluar los microorganismos debido a la creciente complejidad de las comunidades microbianas y sus interacciones con el medio ambiente. Para el mismo género de bacterias, una especie puede ser extremadamente crítica y otra anecdótica. La identificación de especies microbianas permite la investigación completa de las causas fundamentales de la contaminación y apoya a las industrias farmacéuticas en su toma de decisiones. Este enfoque está alineado con las últimas recomendaciones de la Comisión Europea de Buenas Prácticas de Manufactura (GMP), como se detalla en el Anexo 1. La guía establece que todos los microorganismos encontrados en áreas de Grado A (área de operaciones de alto riesgo, como la línea de procesamiento aséptico) o áreas de Grado B (una sala limpia de fondo para una zona de Grado A) deben identificarse según su especie, y también debe establecerse su influencia potencial en la calidad del producto (para los lotes respectivos) y el control de producción. La guía también advierte que es esencial identificar y considerar los microorganismos que se encuentran en las áreas de Grado C y Grado D (salas limpias designadas para etapas menos críticas del proceso de fabricación, como la preparación de soluciones) cuando se superan los límites de acción o los niveles de alerta, o luego del aislamiento de organismos que puedan indicar una disminución del control, falta de limpieza o que sean en sí mismos difíciles de controlar, como los microorganismos formadores de esporas y los mohos. El Anexo 1 de GMP se puede encontrar aquí.7


Ventajas esenciales de la tecnología MALDI-TOF


La técnica MALDI-TOF puede identificar microorganismos grampositivos, gramnegativos, mohos, micobacterias yanaerobios, proporcionando información detallada necesaria para identificar con precisión una contaminación. Los posibles usos incluyen la detección microbiológica temprana en líneas de producción farmacéuticas o de laboratorio. La técnica MALDI-TOF puede ayudar a prevenir la contaminación junto con las consecuencias costosas y que hacen perder tiempo, que pueden traer, como pérdida de lotes y retrasos en la producción. Un estudio comparativo informó que la tecnología MALDI-TOF redujo el tiempo de obtención de resultados de 24 a 48 horas a menos de 30 minutos. Esto permite abordar muy rápidamente los controles microbiológicos, mejorando así la toma de decisiones en las investigaciones microbiológicas realizadas por la industria farmacéutica.


La tecnología MALDI-TOF también puede detectar múltiples contaminaciones en una sola muestra, eliminando retrasos, sin aumento de costos ni pasos adicionales en el proceso: MALDI-TOF permite la autonomía de las pruebas y la reducción de gastos a través de la identificación in situ. Un estudio comparativo estimó que la identificación con MALDI-TOF requirió un tiempo promedio de 6 minutos con una reducción de costos de aproximadamente 70 a 80 % comparado con los métodos convencionales. Una alternativa, como los métodos basados ​​en ácidos nucleicos, es costosa, lleva mucho tiempo y es menos práctica que la tecnología MS para las identificaciones de laboratorio de rutina.14-16


La tecnología MALDI-TOF y VITEK® MS PRIME


bioMérieux tiene más de 50 años de expertise microbiológico y ha utilizado este conocimiento para desarrollar un sistema MALDI-TOF automatizado que cumple con los desafíos del control de calidad microbiológico. Tanto el láser como el método de disparo se han perfeccionado para garantizar la identificación de especies de microorganismos.


Nuestra sólida base de datos, conteniendo diversidad dentro de especies, provee un mejor rendimiento en identificaciones de especies, incluyendo Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans y Aspergillus brasiliensis. Nuestra reciente mejora en la base de datos se enfoca en mohos, micobacterias y muchas especies bacterianas críticas, agregando 286 especies adicionales para 186 especies bacterianas y 107 fúngicas. El algoritmo de cálculo también se modificó para permitir la diferenciación entre especies similares como Bacillus cereus y Bacillus thuringiensis.


La base de datos VITEK® MS PRIME ahora permite la identificación de 1585 especies, incluyendo 16 000 cepas únicas de bacterias, levaduras y mohos en cuestión de minutos. Con un promedio de 12 cepas por especie y una eficiencia de flujo de trabajo mejorada, VITEK® MS PRIME garantiza una identificación de especies precisa y robusta.


La estructura de nuestra base de datos nos permite alcanzar un rendimiento mejorado en la identificación de especies para un grupo farmacéutico crítico: un estudio que utilizó MALDI-TOF MS para diferenciar los grupos Bacillus cereus y Bacillus subtilis informó una alta precisión en la diferenciación entre estas especies cercanas sin ningún paso de extracción. La base de datos utilizada en este estudio comprende 2745 espectros de referencia de 117 especies del género Bacillus y especies relacionadas. Ningún otro sistema MS puede diferenciar estas especies en pruebas de rutina.


Parece que todas las especies dentro de los grupos Bacillus subtilis y Bacillus cereus se distinguen fácilmente, excepto Bacillus weihenstephanensis y Bacillus mycoides en el grupo Bacillus cereus, que se superponen.



El algoritmo VITEK® MS PRIME permite una discriminación precisa de todas las especies dentro de los grupos Bacillus cereus y Bacillus subtilis , con un rendimiento que oscila entre el 98 y el 100 %, y confirma la estrecha relación entre Bacillus weihenstephanensis y Bacillus mycoides con una discriminación relativamente baja.


¿Desea conocer más sobre la tecnología MALDI-TOF?




 

References:

1. Croxatto A, Prod'hom G, Greub G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 2012;36(2):380-407. doi:10.1111/j.1574-6976.2011.00298.x

2. Alizadeh M, Yousefi L, Pakdel F, et al. MALDI-TOF Mass Spectroscopy Applications in Clinical Microbiology. Adv Pharmacol Pharm Sci. 2021;2021:9928238. Published 2021 May 7. doi:10.1155/2021/9928238

3. Pineda FJ, Lin JS, Fenselau C, Demirev PA. Testing the significance of microorganism identification by mass spectrometry and proteome database search. Anal Chem. 2000;72(16):3739-3744. doi:10.1021/ac000130q

4. Carbonnelle E, Beretti JL, Cottyn S, et al. Rapid identification of Staphylococci isolated in clinical microbiology laboratories by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 2007;45(7):2156-2161. doi:10.1128/JCM.02405-06.

5. Alam SI, Kumar B, Kamboj DV. Multiplex detection of protein toxins using MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry: application in unambiguous toxin detection from bioaerosol. Anal Chem. 2012;84(23):10500-10507. doi:10.1021/ac3028678

6. Idelevich EA, Sparbier K, Kostrzewa M, Becker K. Rapid detection of antibiotic resistance by MALDI-TOF mass spectrometry using a novel direct-on-target microdroplet growth assay. Clin Microbiol Infect. 2018;24(7):738-743. doi:10.1016/j.cmi.2017.10.016

7. EU GMP ANNEX 1. Manufacture of Sterile Medicinal. https://www.gmp-compliance.org/guidelines/gmp-guideline/eu-gmp-annex-1-manufacture-of-sterile-medicinal-products. Accessed April 27, 2023.

8. Labandeira-Rey M, Couzon F, Boisset S, et al. Staphylococcus aureus Panton-Valentine leukocidin causes necrotizing pneumonia. Science. 2007;315(5815):1130-1133. doi:10.1126/science.1137165.

9. Bizzini A, Jaton K, Romo D, Bille J, Prod'hom G, Greub G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry as an alternative to 16S rRNA gene sequencing for identification of difficult-to-identify bacterial strains. J Clin Microbiol. 2011;49(2):693-696. doi:10.1128/JCM.01463-10

10. Böhme K, Fernández-No IC, Barros-Velázquez J, Gallardo JM, Cañas B, Calo-Mata P. Rapid species identification of seafood spoilage and pathogenic Gram-positive bacteria by MALDI-TOF mass fingerprinting. Electrophoresis. 2011;32(21):2951-2965. doi:10.1002/elps.201100217

11. Veloo AC, Welling GW, Degener JE. The identification of anaerobic bacteria using MALDI-TOF MS. Anaerobe. 2011;17(4):211-212. doi:10.1016/j.anaerobe.2011.03.026.

12. Fernández-Olmos A, García-Castillo M, Morosini MI, Lamas A, Máiz L, Cantón R. MALDI-TOF MS improves routine identification of non-fermenting Gram negative isolates from cystic fibrosis patients. J Cyst Fibros. 2012;11(1):59-62. doi:10.1016/j.jcf.2011.09.001

13. Bille E, Dauphin B, Leto J, et al. MALDI-TOF MS Andromas strategy for the routine identification of bacteria, mycobacteria, yeasts, Aspergillus spp. and positive blood cultures. Clin Microbiol Infect. 2012;18(11):1117-1125. doi:10.1111/j.1469-0691.2011.03688.x

14. Seng P, Drancourt M, Gouriet F, et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 2009;49(4):543-551. doi:10.1086/600885.

15. Kajiwara H, Murakami R. Application of RT-PCR and MALDI-TOF MS for the detection of RNA luteovirus. Anal Biochem. 2017;539:45-47. doi:10.1016/j.ab.2017.10.003.

16. Khodadadi E, Zeinalzadeh E, Taghizadeh S, et al. Proteomic Applications in Antimicrobial Resistance and Clinical Microbiology Studies. Infect Drug Resist. 2020;13:1785-1806. Published 2020 Jun 16. doi:10.2147/IDR.S238446.


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