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O valor da tecnologia MALDI-TOF na identificação em nível de espécie.


O que é a tecnologia MALDI-TOF?


A espectometria de massa por ionização/dessorção a laser assistido por matriz (MALDI) usa um laser para absorver energia de uma matriz para criar íons com fragmentação mínima de moléculas grandes. Ele pode analisar biopolímeros como DNA, proteínas, peptídeos, carboidratos e outras macromoléculas orgânicas. Na espectrometria de massa (MS) por tempo de voo (TOF), um analisador TOF mede a relação massa-carga (m/z) das moléculas carregadas.


É essencial identificar e diferenciar microrganismos ao realizar testes para diagnosticar doenças, identificar uma fonte de contaminação ou estudar os efeitos de tratamentos ou condições ambientais em populações microbianas. Um dos métodos proteômicos mais potentes, MALDI-TOF MS, é uma maneira rápida, precisa e econômica de reconhecer e diferenciar microrganismos, como bactérias, vírus, parasitas e fungos. Esta tecnologia produz impressões digitais de espectros de massa específicas e exclusivas para cada microrganismo e, portanto, pode identificá-los com precisão no nível de gênero e espécie.1,2


O MALDI-TOF MS compara os espectros produzidos por células intactas com um banco de dados de impressões digitais de maneira simples e rápida, tornando-o ideal para uso em um ambiente de laboratório de controle de qualidade microbiológico. Desenvolve bancos de dados de picos únicos e conservados que podem ser utilizados para identificar espécies e subespécies independentemente das condições de cultivo utilizadas para cultivar o microrganismo.


Outra característica do MALDI-TOF MS envolve a correspondência de massas de biomarcadores a um banco de dados de proteoma: as proteínas são as biomoléculas mais observadas com uma relação massa-carga superior a 4000 m/z em espectros MALDI-TOF derivados de extratos de células inteiras. Portanto, um algoritmo pode prever massas de proteínas de um genoma sequenciado e procurar correspondências com massas derivadas experimentalmente. Essa abordagem baseada em bioinformática é superior ao fingerprinting bacteriano, pois pode identificar microrganismos apesar das variações nos perfis de proteínas, crescimento da cultura e condições de tratamento da amostra. Ele também pode detectar toxinas microbianas e analisar a resistência a antibióticos.3-6


A importância da identificação em nível de espécie em um contexto farmacêutico


O gênero de um determinado organismo não é um indicador preciso de sua espécie. A identificação de gênero por si só não é mais suficiente ao avaliar microorganismos devido à crescente complexidade das comunidades microbianas e suas interações com o meio ambiente. Para o mesmo gênero de bactéria, uma espécie pode ser extremamente crítica e outra anedótica. A identificação de espécies microbianas permite a investigação completa das causas da contaminação e auxilia as indústrias farmacêuticas em suas tomadas de decisão. Essa abordagem está alinhada com as recomendações mais recentes da Comissão Europeia de Boas Práticas de Fabricação (GMP), conforme detalhado no Anexo 1. A orientação afirma que todos os microorganismos encontrados na área de Grau A (área de operações de alto risco, como linha de processamento asséptico) ou área de Grau B (uma sala limpa de fundo para uma zona de Grau A) devem ser identificados para suas espécies, e sua potencial influência na qualidade do produto (para os respectivos lotes) e controle de produção também deve ser estabelecida. A orientação também recomenda que é fundamental identificar e considerar os microorganismos encontrados nas áreas de Grau C e Grau D (salas limpas destinadas a etapas menos críticas do processo de fabricação, como o preparo de soluções) quando os limites de ação ou níveis de alerta são ultrapassados, ou após o isolamento de organismos que possam indicar diminuição do controle, falta de limpeza ou que sejam eles próprios de difícil controle, como microrganismos formadores de esporos e bolores. O Anexo 1 do GMP pode ser encontrado aqui.7



Vantagens essenciais da tecnologia MALDI-TOF


A técnica MALDI-TOF permite identificar Gram-positivos, Gram-negativos, fungos, micobactérias e microrganismos anaeróbicos, fornecendo informações detalhadas necessárias para identificar com precisão a contaminação bacteriana. Uma das aplicações potenciais incluem a detecção microbiana precoce em linhas de produção farmacêuticas ou laboratoriais. A técnica MALDI-TOF pode ajudar a prevenir a contaminação junto com as repercussões caras e demoradas que a contaminação pode trazer, como descarte e atrasos na produção. Um estudo comparativo relatou que a tecnologia MALDI-TOF reduziu o tempo para resultado de 24 a 48 horas para menos de 30 minutos. Isso permite que os controles microbiológicos sejam tratados com muita rapidez, melhorando assim a tomada de decisões nas investigações microbiológicas realizadas pela indústria farmacêutica.



A tecnologia MALDI-TOF também pode detectar múltiplas contaminações em uma única amostra, eliminando atrasos sem aumento de custo ou etapas extras no processo: MALDI-TOF permite autonomia de teste e redução de gastos via identificação internalizada. Um estudo comparativo estimou que a identificação MALDI-TOF exigiu um tempo médio de 6 minutos para uma redução de custo aproximada de 70 a 80% em relação aos métodos convencionais. Uma alternativa, como métodos baseados em ácido nucleico, é cara, demorada e menos prática do que a MS para um laboratório de controle de qualidade.14-16


Tecnologia MALDI-TOF e VITEK® MS PRIME


A bioMérieux tem mais de 50 anos de experiência em microbiologia e usou esse conhecimento para desenvolver um sistema MALDI-TOF automatizado que atende aos desafios do controle de qualidade microbiológico. Tanto o laser quanto o método de disparo foram aperfeiçoados para garantir a identificação das espécies de microrganismos.


Nosso banco de dados robusto, com diversidade intraespécie, facilita um desempenho aprimorado de identificação de espécies, incluindo Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans e Aspergillus brasiliensis. Nosso último aprimoramento no banco de dados se concentra em fungos, micobactérias e muitas espécies bacterianas críticas, incluindo 286 espécies adicionais, sendo 186 espécies bacterianas e 107 espécies fúngicas. O algoritmo de cálculo também foi reformulado para permitir a diferenciação entre espécies próximas, como Bacillus cereus e Bacillus thuringiensis.


O banco de dados VITEK® MS PRIME agora permite a identificação de 1.585 espécies, incluindo 16.000 cepas únicas de bactérias, leveduras e bolores em minutos. Com uma média de 12 cepas por espécie e maior eficiência do fluxo de trabalho, o VITEK® MS PRIME garante uma identificação precisa e robusta das espécies.


A estrutura de nosso banco de dados nos permite alcançar um melhor desempenho de identificação de espécies para um grupo farmacêutico crítico: um estudo utilizando MALDI-TOF MS para diferenciar os grupos Bacillus cereus e Bacillus subtilis relatou alta precisão na diferenciação entre essas espécies próximas sem qualquer etapa de extração. O banco de dados utilizado neste estudo compreende 2.745 espectros de referência de 117 espécies entre o gênero Bacillus e espécies relacionadas. Nenhum outro sistema MS pode diferenciar essas espécies em testes de rotina.


Parece que todas as espécies dentro dos grupos Bacillus subtilis e Bacillus cereus são facilmente distinguíveis, exceto para Bacillus weihenstephanensis e Bacillus mycoides no grupo Bacillus cereus , que se sobrepõem.



O algoritmo do VITEK® MS PRIME permite a discriminação precisa de todas as espécies dentro dos grupos Bacillus cereus e Bacillus subtilis , com desempenho variando de 98 a 100%, e confirma a estreita relação entre Bacillus weihenstephanensis e Bacillus mycoides com discriminação relativamente baixa.


Quer saber mais sobre a tecnologia MALDI-TOF?




 

Referências:

1. Croxatto A, Prod'hom G, Greub G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 2012;36(2):380-407. doi:10.1111/j.1574-6976.2011.00298.x

2. Alizadeh M, Yousefi L, Pakdel F, et al. MALDI-TOF Mass Spectroscopy Applications in Clinical Microbiology. Adv Pharmacol Pharm Sci. 2021;2021:9928238. Published 2021 May 7. doi:10.1155/2021/9928238

3. Pineda FJ, Lin JS, Fenselau C, Demirev PA. Testing the significance of microorganism identification by mass spectrometry and proteome database search. Anal Chem. 2000;72(16):3739-3744. doi:10.1021/ac000130q

4. Carbonnelle E, Beretti JL, Cottyn S, et al. Rapid identification of Staphylococci isolated in clinical microbiology laboratories by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 2007;45(7):2156-2161. doi:10.1128/JCM.02405-06.

5. Alam SI, Kumar B, Kamboj DV. Multiplex detection of protein toxins using MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry: application in unambiguous toxin detection from bioaerosol. Anal Chem. 2012;84(23):10500-10507. doi:10.1021/ac3028678

6. Idelevich EA, Sparbier K, Kostrzewa M, Becker K. Rapid detection of antibiotic resistance by MALDI-TOF mass spectrometry using a novel direct-on-target microdroplet growth assay. Clin Microbiol Infect. 2018;24(7):738-743. doi:10.1016/j.cmi.2017.10.016

7. EU GMP ANNEX 1. Manufacture of Sterile Medicinal. https://www.gmp-compliance.org/guidelines/gmp-guideline/eu-gmp-annex-1-manufacture-of-sterile-medicinal-products. Accessed April 27, 2023.

8. Labandeira-Rey M, Couzon F, Boisset S, et al. Staphylococcus aureus Panton-Valentine leukocidin causes necrotizing pneumonia. Science. 2007;315(5815):1130-1133. doi:10.1126/science.1137165.

9. Bizzini A, Jaton K, Romo D, Bille J, Prod'hom G, Greub G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry as an alternative to 16S rRNA gene sequencing for identification of difficult-to-identify bacterial strains. J Clin Microbiol. 2011;49(2):693-696. doi:10.1128/JCM.01463-10

10. Böhme K, Fernández-No IC, Barros-Velázquez J, Gallardo JM, Cañas B, Calo-Mata P. Rapid species identification of seafood spoilage and pathogenic Gram-positive bacteria by MALDI-TOF mass fingerprinting. Electrophoresis. 2011;32(21):2951-2965. doi:10.1002/elps.201100217

11. Veloo AC, Welling GW, Degener JE. The identification of anaerobic bacteria using MALDI-TOF MS. Anaerobe. 2011;17(4):211-212. doi:10.1016/j.anaerobe.2011.03.026.

12. Fernández-Olmos A, García-Castillo M, Morosini MI, Lamas A, Máiz L, Cantón R. MALDI-TOF MS improves routine identification of non-fermenting Gram negative isolates from cystic fibrosis patients. J Cyst Fibros. 2012;11(1):59-62. doi:10.1016/j.jcf.2011.09.001

13. Bille E, Dauphin B, Leto J, et al. MALDI-TOF MS Andromas strategy for the routine identification of bacteria, mycobacteria, yeasts, Aspergillus spp. and positive blood cultures. Clin Microbiol Infect. 2012;18(11):1117-1125. doi:10.1111/j.1469-0691.2011.03688.x

14. Seng P, Drancourt M, Gouriet F, et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 2009;49(4):543-551. doi:10.1086/600885.

15. Kajiwara H, Murakami R. Application of RT-PCR and MALDI-TOF MS for the detection of RNA luteovirus. Anal Biochem. 2017;539:45-47. doi:10.1016/j.ab.2017.10.003.

16. Khodadadi E, Zeinalzadeh E, Taghizadeh S, et al. Proteomic Applications in Antimicrobial Resistance and Clinical Microbiology Studies. Infect Drug Resist. 2020;13:1785-1806. Published 2020 Jun 16. doi:10.2147/IDR.S238446.


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